資料來源:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2772209/

 

摘要

月桂酸〈C12:0〉,是一種常見於天然食物的中鏈脂肪酸,在很多的相關研究中都發現到它有著強大的抗菌的特性。然而,這些研究並沒有證明月桂酸是否可以作為一種治療痤瘡天然的抗菌劑,而痤瘡丙酸桿菌正是促使濾泡發炎的病原〈發炎性痤瘡/青春痘〉。這項研究評估了月桂酸在試管內跟在活體內抵抗痤瘡丙酸桿菌的抗菌性。利用肌膚上的痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌的培養後,月桂酸的對細菌生長的最小抑菌濃度〈MIC,越小表示抗菌效果越好〉竟然比使用過氧化苯〈BPO〉還要低15倍以上。月桂酸這樣較低的MIC值表明了他的抗菌效果比過氧化苯來得更強大。月桂酸對這些病菌的生長的EC50的偵測值〈half maximal effective concentration ,半最大效用濃度,會到達最大效果的50%情形的濃度〉顯示,痤瘡丙酸桿菌在這些病菌當中,對月桂酸是最敏感的。此外,月桂酸並不會給人體的皮脂帶來任何的細胞毒性。值得注意的是,月桂酸利用皮內注射與施用於表皮的這兩種方式,都有效減少了植入老鼠耳朵的痤瘡丙酸桿菌的數量因而緩解痤瘡丙酸桿菌所帶來的腫脹與肉芽腫性發炎。這些資料強調了使用月桂酸作為一種可替代抗生素治療尋常性痤瘡的療法。

 

緒論

尋常性痤瘡〈Acne vulgaris〉是人體肌膚最常見的疾病,大約有高達80%受到這種疾病的影響 (Dreno and Poli, 2003)。痤瘡〈acne〉會有以下這些症狀包括:粉刺〈comedones〉、丘疹〈papules〉、結節〈nodules〉、囊腫〈cysts〉與毛囊皮脂發炎〈pilosebaceous inflammation〉。在這些症狀當中,患者最介意的是痤瘡的發炎性的病變,是因為它會造成痘疤〈acne scarring〉而造成不好的心理影響。痤瘡丙酸桿菌〈propionibacterium acnes (P. acnes)〉是一種革蘭氏陽性厭氧菌,它大多會寄宿在肌膚的毛皮脂腺囊〈pilosebaceous follicles〉裡。雖然痤瘡丙酸桿菌是片利共生〈commensal〉的細菌區系〈bacterial flora〉裡的一分子,當它在毛囊皮脂裡過度發育與寄居時,它就會在發炎性痤瘡的生長中起了一個關鍵性的作用。(Leeming et al., 1988; Cunliffe and Gollnick, 2001; Leyden, 2001; Bojar and Holland, 2004) 痤瘡丙酸桿菌的基因體學分析顯示了它各式各樣的致病性。〈pathogenicity〉(Bruggemann et al., 2004) 痤瘡丙酸桿菌的完整基因組相關的更進一步的研究顯示,許多控管產物的基因參與了宿主分子的降解並刺激了發炎反應。(Bruggemann, 2005; Rosen, 2007) 發炎性痤瘡是因為宿主的免疫系統對痤瘡丙酸桿菌作的反應而造成的,這樣的理論也已經被廣泛地接受。痤瘡丙酸桿菌釋放了化學活性因子,吸引了像是中性粒细胞〈neutrophils〉、單核細胞〈monocytes〉與淋巴細胞〈lymphocytes〉這樣的免疫系統的細胞。(Webster and Leyden, 1980; Burkhart et al., 1999) 過去的研究已經發現到,痤瘡丙酸桿菌刺激了促炎性細胞因子,像是白細胞介素-−1β, −8, −12〈interleukins−1β, −8, −12〉與腫瘤壞死因子-α〈 tumor necrosis factor-α〉的生產。痤瘡丙酸桿菌所引發的細胞因子是被類鐸受體2〈toll-like receptor 2〉所調和〈mediated〉的。(Kim et al., 2002; Kim, 2005; Nagy et al., 2006)

 

因為在頭髮毛囊皮脂中的痤瘡丙酸桿菌數量受到抗菌介質的影響而減少是與罹患痤瘡的病患的臨床試驗的改善有關係,抗菌藥物被用於治療痤瘡已經長達數十年了,而且到現在仍然是開給有痤瘡的病患的藥方。過氧化苯甲醯〈BPO〉,這樣的氧化劑已經是最常用於痤瘡治療的局部藥物治療的其中一種。它通常用於那些罹患輕微至中度痤瘡的人的最初期〈first line〉的藥物。BPO也可以與抗菌介質以及維他命A酸〈isotretinoin〉這樣的系統性療法作結合。它主要的反應機制被認為是抗菌的特性,儘管也可能存在輕微的抗炎效果與非常溫和的抗致粉刺的效果。 (Gollnick and Schramm, 1998)

 

透過不同反應模式的人體肌膚表面的自體消毒〈self-disinfection〉,已經被建議用這樣的方式消除病菌很久了。目前已知,游離脂肪酸〈FFAs, free fatty acids〉和抗菌生物肽〈antimicrobial peptides〉至少是形成肌膚表面抗病菌移生〈colonization〉的自體消毒活性的一個環節。(Gallo and Huttner, 1998; Drake et al., 2008)  FFAs是由皮脂腺分泌而成的皮脂三酸甘油脂〈sebum triacylglycerides〉而且接著透過片利共生的細菌區系〈包括痤瘡丙酸桿菌〉的脂解脢〈lipases〉的水解而釋放出來。 (Holland et al., 1981) 已經發現到各式各樣的FFAs有著抗菌的特性可以抵抗一部分的革蘭氏陽性菌〈Gram-positive bacteria〉,但不是革蘭氏陰性菌〈Gram-negative bacteria〉。月桂酸,是皮脂裡的一種微量的成分,是抗菌最有潛力的一種飽和脂肪 (Wille and Kydonieus, 2003) 它常見於天然食物,像是可可椰子跟牛奶裡面。雖然月桂酸在許多的革蘭氏陽性菌上發揮了強大的抗菌的特性(Kabara et al., 1972; Kitahara et al., 2004; Rouse et al., 2005; Skrivanova et al., 2005),但是,在活體內還不知道是否對痤瘡丙酸桿菌有著類似的效果,因此,月桂酸作為治療痤瘡的一種天然的抗菌的介質的效果也是未知的。在這項研究中,我們已經展示了月桂酸作為治療痤瘡的一種替代選擇的效果。有趣的是,對於肌膚上的病菌,包括痤瘡丙酸桿菌而言,月桂酸在試管內展現了比BPO還要好的抗菌效果。實驗的結果也顯示了對於活體內痤瘡丙酸桿菌所致的發炎,月桂酸有著治療上的潛能。

 

結果

月桂酸與BPO在肌膚病菌上發揮的抗菌效果

為了要比較月桂酸、BPO對於細胞群系生長的劑量反應,利用痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌共生的方式,分別用各種不同的濃度加入這兩種抗菌介質,然後個別放置72、24與48小時。細菌的生長是以600nm的吸收度〈absorbance〉作計算〈圖表一〉。培養細菌時間是以細菌的生長速度作為基準。月桂酸跟BPO都是從0.24至0.50μg ml−1 這樣的濃度以兩倍連續稀釋試驗法〈twofold serial dilutions〉作評測。這兩種在高濃度的時候並沒有去做評估是因為當細菌在繁殖時,月桂酸跟BPO都呈現沉澱的狀態 (Figure S1)而且在600nm時干擾了光密度〈optical density,OD〉的測量〈OD600〉。最小抑菌濃度〈minimal inhibitory concentration, MIC〉,也就是預防細菌生長的最小濃度,而月桂酸竟然比BPO還小15倍。從這個現象可以推測,月桂酸有著比BPO還要好的抗菌活性(Table 1)。而在參與實驗的所有菌種中,月桂酸在痤瘡丙酸桿菌生長的半最大效用濃度〈half maximal effective concentration,會到達最大效果的50%情形的濃度〉是最低的,這可以推測,痤瘡丙酸桿菌比金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌還要更敏感(Table 1) 。月桂酸的MIC值〈1.95 μg/ml〉與半最大效用濃度〈1.5μg/ml〉也被確定是可以用於不同品系的痤瘡丙酸桿菌(ATCC 11827) (Figure S2).


 

圖表一:月桂酸對於細菌生長的抑制效果

A.痤瘡丙酸桿菌〈每毫升An external file that holds a picture, illustration, etc.
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1× 106個菌落形成單位〉

B.金黃色葡萄球菌

  菌種ATCC35556

 〈每毫升1 × 106個菌落形成    單位〉


 

C.  表皮葡萄球菌

  菌種ATCC12228

〈每毫升1 × 106個菌落形成單位〉

 

分別在月桂酸〈實心圓圈〉和BPO〈空心圓圈〉於5%濃度的DMSO〈二甲基亞碸〉的37C的厭氧環境下經過72、24及48小時。

 

在培養〈incubation〉後,以一個微量盤分析儀測量來定義各個樣本OD600的細菌生長。這三種個別實驗的資料的表現方式是以平均數±標準差來作表示〈(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0005,是用T試驗的方式)

 

表一

月桂酸與BPO〈過氧化苯〉分別在痤瘡丙酸桿菌〈P. acnes〉、金黃色葡萄球菌〈S. aureus〉與表皮葡萄球菌〈 S. epidermidis〉的MIC與EC50







 

 

MIC〈最小抑菌濃度,μg/ml〉〈註1〉

EC50〈半最大效用濃度,μg/ml〉〈註1〉

菌種

痤瘡丙酸桿菌

金黃色葡萄球菌

表皮葡萄球菌

痤瘡丙酸桿菌

金黃色葡萄球菌

表皮葡萄球菌

月桂酸

3.9

0.97

3.9

2

6

4

BPO

62.5

15.6

>100

60

30

尚未確定

 

註1:MIC和EC50的定義是源自於圖表一的劑量依賴〈dose-dependent〉曲線

 

為了要確定月桂酸的最低殺菌濃度〈minimal bactericidal concentration , MBC〉,痤瘡丙酸桿菌被放在37C的無氧的PBS〈磷酸鹽緩衝生理鹽水〉有著不同的月桂酸的濃度的溶液裡五個小時。在痤瘡丙酸桿菌繁殖後,被PBS稀釋並點在瓊脂平板上來計算它的菌落形成單位〈 colony-forming unit (CFU)〉〈圖表二〉。我們發現,當月桂酸的濃度比 60 μg/ml還要高的時候,月桂酸會開始摧毀痤瘡丙酸桿菌。相對而言,沒有任何一個痤瘡丙酸桿菌會在月桂酸濃度50μg/ml的時候被殺死。因此我們估計,抗痤瘡丙酸桿菌〈菌種ATCC 6919〉的月桂酸的MBC〈最低殺菌濃度〉是60 μg/ml,而同個實驗中另一個痤瘡丙酸桿菌〈菌種ATCC 11827〉的月桂酸MBC為80μg/ml

 

圖表二:月桂酸在痤瘡丙酸桿菌〈P. acnes〉的殺菌效果

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痤瘡丙酸桿菌〈1 × 107 CFU/毫升〉是在厭氧環境下添加0-100 μg/ml濃度的月桂酸與5%二甲基亞碸的PBS溶液中培養〈incubation〉5小時。在培養過後,痤瘡丙酸桿菌懸浮液在PBS溶液中稀釋成1:10到1:106的濃度而且5μl的稀釋溶液是點在配有5%的去纖維棉羊血、高鐵血紅素〈hemin〉與維生素K的布魯氏菌肉湯瓊脂〈Brucella broth agar plate〉上。在痤瘡丙酸桿菌的懸浮液被吸收進瓊脂後,這個瓊脂是在驗氧的環境下計算它的CFU〈菌落形成單位〉。資料的表現方式是以平均數±標準差來作表示〈(**P<0.005,是用T試驗的方式)〈UD:檢測不到〉

 

月桂酸的細胞毒性細胞受到釋放出的有毒物質而引起的細胞毒性反應〉

罹患痤瘡的病人的皮脂是痤瘡丙酸桿菌的一個主要的標靶細胞。所以月桂酸的細胞毒性被用於檢測SZ95〈一種人類永生皮脂腺細胞株〉 (Zouboulis et al., 1999)〈圖表三〉在研究中,SZ95皮脂腺細胞在添加0.24-500 μg/ml這樣不同濃度的月桂酸中培養〈incubation〉18小時,並接著確定了細胞的存活率〈cell viability〉。發現到,月桂酸在任何測試的濃度下並不會影響細胞的存活率。值得注意的是,月桂酸甚至在125μg /ml這樣可以完全殺死痤瘡丙酸桿菌〈圖表二的高濃度的情況下,竟然不會影響SZ95的細胞存活率。


 

圖表三:月桂酸在人類皮脂〈sebocytes〉的細胞毒性

 

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人類永生皮脂腺細胞株〈The immortalized human sebocytes〉-SZ95是在有著1%濃度的胎牛血清與濃度5ng/ml的EGF 的Sebmed這樣指定的月桂酸濃度下於37C的環境下作培養的。為了要設定基準,所以會添加Triton X-100 [0.1% (v v−1)]來達到100%的細胞毒性。在培養過後,皮脂的細胞存活率是被磷酸-4-硝基苯酯二鈉鹽所決定的。而且中性的混合劑的細胞毒性是與《材料與方法》的計算的方式是相同的。五個個別實驗的資料的表現方式是以平均數±標準差來作表示

 

使用老鼠耳朵作為發炎性痤瘡的樣板

為了要用痤瘡丙酸桿菌在活體產生發炎反應,於是就把1 × 107 個菌落單位的痤瘡丙酸桿菌利用皮內注射的方式植入ICR〈癌症研究院,Institute of Cancer Research〉的小鼠耳朵裡。在注射後24小時,我們觀察到,被皮內注射的小鼠耳朵有著明顯腫脹的現象(圖表 4a)。組織學方面的觀察顯示,注射痤瘡丙酸桿菌造成可觀的受炎症滲透的細胞數量的增加(圖表 4b)。在穿透式電子顯微鏡〈 Transmission electron microscopy〉上顯示,在注射24小時後,寄宿和/或是吞噬的痤瘡丙酸桿菌是在巨噬細胞樣細胞裡面〈macrophage-like cells〉(Figure 4c and d),但是在注射PBS溶液的小鼠耳朵裡面並沒有發現到有任何的細菌 (圖表 4e)。此外,螢光免疫組織化學法〈fluorescent immunohistochemistry〉被用於讓受痤瘡丙酸桿菌注射的耳朵跟注射PBS的耳朵的變化可以被觀察得到,個別地使用抗鼠抗體CD11b IgG,一種慣用的巨噬細胞的標記。在痤瘡丙酸桿菌注射的地方可以觀察得到巨噬細胞CD11b+的浸透(圖表 4f),但是在PBS溶液注射的地方〈控制組〉並沒有看到有任何的巨噬細胞CD11b+  (圖表 4g)。

 

圖表4使用老鼠耳朵作為發炎性痤瘡的樣板

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分別在ICR小鼠左耳注入1 × 107 個菌落單位/20μl,在右耳注入20μl的PBS熔液,然後經過24小時候用蘇木精-伊紅染色〈H&E staining〉〈圖a、圖b〉、穿透式電子顯微鏡〈圖c到e〉與螢光免疫組織化學法〈圖f、圖g〉觀察。在H&E染色並注射痤瘡丙酸桿菌的耳朵〈圖b〉中發現,在注射痤瘡丙酸桿菌的周圍會有增加耳朵厚度與浸透炎症的細胞〈箭頭處〉,但這種現象並不會出現在注入PBS溶液的耳朵裡〈圖a〉。圖中的比例尺為200μm。在巨噬細胞樣細胞裡可以觀察到寄宿和/或是吞噬的痤瘡丙酸桿菌〈圖c和圖d,分別將顯微鏡鏡頭放大8000與24000倍〉,但在注射PBS溶液的耳朵裡〈控制組〉並沒有看到〈圖e,將顯微鏡鏡頭放大24000倍〉。圖中比例尺為4μm。圖f跟圖g都是加入抗鼠抗體CD11b IgG,一種慣用的巨噬細胞的標記,並接著使用 TRITC-streptavidin conjugate〈紅〉與4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色〈藍〉。在注射痤瘡丙酸桿菌的耳朵可以觀察到許多CD11b陽性的巨噬細胞的滲透〈圖f〉,但在注射PBS溶液的耳朵裡〈控制組〉並沒有看到〈圖g〉。圖中的虛線代表的是耳朵部分的輪廓。四個不同的資料都顯示出類似的結果。比例尺:200μm。

 

月桂酸對活體內痤瘡丙酸桿菌與痤瘡丙酸桿菌所致的發炎的效果

為了要檢測月桂酸在活體內的抗菌效果,於是就先將痤瘡丙酸桿菌注入老鼠耳朵裡(1 × 107 CFU)。經過一天後,在痤瘡丙酸桿菌注入處再注入月桂酸 (2 μg) (圖表 5)。注入月桂酸後,發現到耳朵腫脹的部分 (圖表5a)還有寄宿在耳朵的痤瘡丙酸桿菌都有減少 (圖表5b)。組織學的圖像顯示,相較於賦形劑〈vehicle〉(Figure 5e),等量的月桂酸是可以減少痤瘡丙酸桿菌所致的肉芽腫〈granulomatous〉的反應(圖表 5d),而單獨只注射月桂酸〈沒有先注射痤瘡丙酸桿菌〉並不會引起發炎反應 (圖表 5c)。此外,TUNEL檢測〈TUNEL assay是一種通過標記核酸末端從而檢測DNA片段的方法〉顯示,月桂酸的注入並不會觸發皮膚細胞的細胞凋亡〈apoptosis〉(圖表 S4)。為了要檢測月桂酸加在表皮作為一種痤瘡治療的治療功效,凡士林〈有150μg的月桂酸〉被塗在注入痤瘡丙酸桿菌(1 ± 107 CFU)的老鼠耳朵表皮上。經過一天後,腫脹(圖表 6a)與寄宿在耳朵裡的痤瘡丙酸桿菌有明顯的減少 (圖表 6b)。此外,從TUNEL檢測的資料足以推論,添加在表皮的月桂酸並不會造成分化角化細胞〈differentiated keratinocyte〉的凋亡(圖表 6c)。從這些資料可以推論,月桂酸添加在表皮是可以有效痤瘡丙酸桿菌所致的發炎而不會讓皮膚細胞受到傷害。

 

圖表5:月桂酸對活體內痤瘡丙酸桿菌與痤瘡丙酸桿菌所致的發炎的效果

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分別在ICR小鼠左耳注入1 × 107 個菌落單位/20μl,在右耳注入20μl的PBS熔液。作為控制組,等量〈20μl〉的5%DMSO的PBS溶液被注射在兩邊的耳朵裡〈a〉。在注射前和注射細菌的24小時之後使用微型卡尺〈micro caliper〉測量耳朵的厚度〈b〉。在小鼠耳朵裡注入痤瘡丙酸桿菌與200μl均質的無菌PBS溶液的24小時後,使用8mm的活組織切片並用組織磨碎機〈tissue grinder〉作檢查。然後利用瓊脂來記下不同濃度的均質熔液中的痤瘡丙酸桿菌的CFU。資料的表現方式是以平均數±標準差來作表示(*P<0.05, ***P<0.0005,是用T試驗的方式)〈c-d〉。僅注入月桂酸的耳朵〈c〉、注射月桂酸和痤瘡丙酸桿菌的耳朵〈d〉與注入痤瘡丙酸桿菌和賦形劑〈e〉〈在PBS熔液裡有5% DMSO〉都用橫切面作分析,並使用H&E染色。在注入痤瘡丙酸桿菌耳朵的H&E染色冷凍切片的部分可以看到耳朵厚度〈箭號〉與注入痤瘡丙酸桿菌的周圍的浸透炎症的細胞〈箭頭處〉的增加而且在月桂酸在裡面時會減少〈e〉。四個不同的資料都顯示出類似的結果。比例尺:200μm。

 

圖表6:月桂酸加在表皮後對於活體的痤瘡丙酸桿菌的生長以及痤瘡丙酸桿菌作致發炎的影響

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分別在ICR小鼠左耳注入1 × 107 個菌落單位/20μl,在右耳注入20μl的PBS熔液〈控制組〉。月桂酸〈150μg與有著5%濃度的丙酮及15mg的凡士林作混合〉與5%濃度的丙酮及15mg的凡士林的混合液〈賦形劑〉分別加在左耳跟右耳〈a〉。在注射前和注射細菌的24小時之後使用微型卡尺〈micro caliper〉測量耳朵的厚度。而注入痤瘡丙酸桿菌耳朵的厚度增加是以注入PBS溶液的耳朵〈控制組〉作為標準〈b〉。在小鼠耳朵裡注入痤瘡丙酸桿菌與200μl均質的無菌PBS溶液的24小時後,使用8mm的活組織切片,然後利用瓊脂來記下不同濃度的均質熔液中的痤瘡丙酸桿菌的CFU。資料的表現方式是以平均數±標準差來作表示(**P<0.005, ***P<0.0005,是用T試驗的方式)〈c〉。為了要檢測月桂酸加在表皮後在活體內對角質形成細胞的細胞毒性反應,於是耳朵就用TUNEL作檢測並加入兔子的抗體K10 IPG〈一種分化角質細胞的標記〉,接著使用山羊的抗兔子IgG-TRITC結合物〈 IgG-TRITC conjugate〉〈紅〉。中間〈Nuclei〉是由4',6-二脒基-2-苯基吲哚〈藍〉染色。添加月桂酸的皮膚並沒有偵測到任何的凋亡的分化角質細胞〈箭號〉〈apoptotic differentiated keratinocytes〉。在添加月桂酸與賦形劑的皮膚上都發現一些凋亡的細胞自然地出現在真皮裡面〈箭頭〉。圖中的虛線代表的是耳朵部分的輪廓。六個不同的資料都顯示出類似的結果。比例尺:200μm。

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